发布日期：2024-12-25 05:16 点击次数：201
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破骨细胞(osteoclast)在牙周炎、骨质疏松、骨肿瘤等好多疾病的骨破碎中发挥着要道作用[1-2]。Ca2+/calmodulin/NFATc1信号通路对破骨细胞分化至关遑急，而钙离子/钙调卵白依赖性卵白激酶Ⅱ(Ca2+/Calmodulin dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ)是其中Ca2+信号传递的要道分子[3-5]。活化T细胞核因子卵白c1(nuclear factor of activated T cells type c1，NFATc1)行为破骨细胞遑急调整因子，参与好多破骨细胞特异性基因(如cathepsin K、TRAP、integrinβ3、c-Src)抒发的调控。海外学者计划标明，在CaMKⅡα、β、γ、δ 4个异构体中，异构体δ在破骨细胞分化中抒发最高[6]，提醒其在破骨细胞分化中可能上演要道脚色，但其发挥的作用及可能的分子机制当前尚不了了。本计划通过对CaMKⅡδ进行RNA干涉，探索其对卑劣干系基因抒发及破骨细胞分化的影响，以证据CaMKⅡδ在破骨细胞分化中的要道作用，揭示破骨细胞分化的分子调控机制，为骨过度招揽性疾病的营救提供现实依据。
1 材料与步调 1.1 现实材料核因子-κB受体激活因子配体(receptor activatior of nuclear factor kappa B ligand， RANKL)，好意思国Biovision公司；小鼠RAW264.7细胞株，北京军事医学科学院；α-MEM培养基，中国四季青公司；兔抗鼠CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP、c-Src多克隆抗体及β-actin单克隆抗，好意思国Santa Cruz公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)、碘化丙啶(PI)，好意思国Sigma公司；PCR引物，上海生工；激光聚焦显微镜(LSCM)，日本Olympus公司；PCR扩增仪，好意思国PERKIN ELMER；Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪，好意思国Gene company limited。
1.2 CaMKⅡδ干涉载体构建及转染后果测定字据GenBank数据库CaMKⅡδ(NM-00102543 8)基因序列并参考文件[7]，笃定干涉靶点为5′-TTCTGGAGAAAGATACCCAGGTGTG-3′；将合成的干涉序列与慢病毒载体pGCSIL-GFP (green fluorescent protein)相接酿成重组干涉载体，并与赞助载体pHelper 2.0共转染293T细胞进行包装；索要重组病毒液，-80 ℃储存备用。以上现实操作由上海吉凯基因公司完成。
诳骗包装好的重组病毒在感染复数(multiplicity of infection，MOI)值分散为1、10、30、50下转染小鼠RAW264.7细胞。转染12 h后更换崭新培养基，转染5 d后激光共聚焦显微镜(LSCM)下不雅察；笃定转染后果高、细胞情景好的最好MOI值；并字据如下公式笃定转染后果：GFP阳性细胞数/所测细胞总和×100%。
1.3 现实分组RAW264.7细胞分为3组：对照组、空缺载体组和干涉组。细胞接种24 h后分散诳骗空缺载体及干涉载体进行转染，12 h后更换含50 μg/L RANKL的α-MEM培养基，持续培养5d后得益细胞，进行干系检测。
1.4 干涉后果测定 1.4.1 Real-time PCR检测TRIzol索要细胞总RNA，逆转录合成cDNA；在Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪上进行变性、退火、延迟；引物序列：CaMKⅡδ(409 bp)，正义链5′-CAGTGGAGCTGTCTGTCGTT-3′，反义链5′-GCAGACTACCACGCAACTCA-3′；β-actin (186 bp)，正义链5′-GTTG GAGCAAACATCCCCCA-3′，反义链5′-CGCGA CCATCCTCCTCTTAG-3′。反映条目：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cylces。分析软件Rotor-Gene科罚后得数据，猜想指标基因mRNA相对抒发量，每组设3个复孔，现实调换3次。
1.4.2 Western blot检测索要细胞总卵白，测定卵白浓度，加入上样缓冲液后，煮沸变性，卵白上样后，凝胶电泳，转膜，室温阻塞1 h，一抗4℃过夜，二抗37℃孵育2 h，ECL显色仪上显色1 min。用Image-Pro Plus分析软件检测膜上条带光密度值；每组设3个复孔，现实调换3次。
1.5 CaMKⅡδ RNA干涉对NFATc1、TRAP、c-Src基因抒发的影响 1.5.1 免疫荧光化学检测按2×104个/cm2密度接种细胞爬片，再分组科罚(同现实1.3)。细胞得益后，4%多聚甲醛固定，0.4%的Triton X-100 PBS室温孵育15 min，多克隆抗体一抗4 ℃过夜，异硫氰酸荧光素(FITC)记号的羊抗兔IgG为二抗，37 ℃避光孵育90 min，碘化丙啶(PI)复染胞核，甘油封片，激光共聚焦显微镜不雅察，每组检测3个细胞爬片，现实调换3次。
1.5.2 Real-time PCR检测现实步调同1.4，所用引物见表 1。
探花极品 1.5.3 Western blot检测现实步调同1.4。
1.6 破骨细胞生成及功能检测 1.6.1 TRAP染色按2×104个/cm2密度接种细胞爬片，再分组科罚(同现实1.3)。细胞得益后，按照TRAP染色试剂盒评释进行染色。光镜200倍下随即及第6个视线，计数TRAP+多核细胞数量(胞核≥3个)，取平均值[8]。每组检测5个细胞爬片。
1.6.2 骨招揽陷窝检测用崭新离体牙制备厚约0.2mm的牙本色磨片，高温高压灭菌，细胞接种密度为2×104个/cm2，再分组科罚(同现实1.3)。细胞得益后，扫描电镜(SEM)不雅察，500倍下每个磨片上及第6个视线，测量招揽陷窝总和目及总面积[8]，取平均值，行为该磨片的招揽陷窝数量及面积。每组检测5个牙本色磨片。
1.7 统计学分析用SPSS 17.0统计软件对数据进行单成分方差分析，计量数据用x±s示意；两组间比拟选拔LSD法；锻练水准设为α=0.05。
2 截止 2.1 转染最好MOI值及转染后果重组干涉载体转染RAW264.7细胞5d后，当MOI值分散为1、10、30、50时，转染后果分散为5.3%、43.6%、78.0%和89.4%；跟着MOI值增多，转染后果冉冉增多。MOI值为50时，转染后果诚然最高，但部分细胞出现变形、零碎；故本现实最好MOI值为30，转染后果为78.0%(P < 0.05)。
2.2 干涉后果测定经Real-time PCR检测，对照组、空缺载体组和干涉组CaMKⅡδ mRNA水平分散为(1.094±0.101)、(0.986±0.007)和(0.214±0.004)；干涉组较前两组mRNA水平分散着落了80.4%和78.3%；即干涉后果>78%，烦扰现实要求。
经Western blot检测，3组CaMKⅡδ卵白条带见图 1。对照组、空缺载体组和干涉组CaMKⅡδ卵白相对水平(与β-actin的比值)分散为1.052、1.016和0.300；干涉组卵白抒发较前两组分散着落了71.5%和70.4%；即卵白水平干涉后果>70%，进一步印证CaMKⅡδ RNA干涉的有用性。
2.2 CaMKⅡδ RNA干涉对卑劣因子NFATc1、TRAP、c-Src基因抒发的影响 2.2.1 经免疫荧光细胞化学检测NFATc1、TRAP、c-Src在对照组和空缺载体组中均呈强阳性抒发，而在干涉组中抒发清澈较弱(图 2)。上述截止评释，CaMKⅡδ RNA干涉显贵阻碍了破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src的卵白抒发。
2.2.2 Real-time PCR检测3组细胞NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平互异有统计学真理(P < 0.01，表 2)；其中干涉组NFATc1、TRAP、c-Src基因mRNA水平较对照组分散着落了53.3%、49.1%和54.6%，较空缺载体组分散着落了47.8%、43.3%和48.5%。上述截止评释，CaMKⅡδ RNA干涉显贵下调了卑劣因子NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平。
2.2.3 Western blot检测3组细胞NFATc1、TRAP、c-Src卵白条带见图 3A。干涉组NFATc1、TRAP、c-Src卵白相对水平(与β-actin比值)显贵低于前两组(图 3B)；较对照组分散着落了61.1%、48.2%和39.6%(P < 0.01)，较空载载体组分散着落了61.6%、46.3%、38.3%(P < 0.01)；而对照组与空缺载体组间则无统计学互异(P>0.05)。上述截止提醒，CaMKⅡδ RNA干涉显贵下调了破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src的卵白抒发。
2.3 CaMKⅡδ RNA干涉对破骨细胞分化和骨招揽的影响经TRAP染色，3组细胞均有TRAP+多核破骨细胞产生(图 4)；但干涉组破骨细胞数量较对照组和空缺载体组显贵减少(P < 0.01，表 3)，分散着落了52.8%和49.3%。上述截止提醒，CaMKⅡδ RNA干涉显贵阻碍了破骨细胞分化。
扫描电镜不雅察，可见3组细胞均有牙本色招揽陷窝酿成(图 4)；但干涉组牙本色招揽陷窝数量和面积较对照组和空缺载体组显贵减少(P < 0.01，表 3)，其中招揽陷窝数量分散着落了55.68%和53.3%，招揽陷窝面积分散着落了60.2%和57.7%。上述截止提醒，CaMKⅡδ RNA干涉可显贵阻碍破骨细胞骨招揽功能。
3 商讨破骨细胞生成干系信号通路计划频年来取得了好多进展，其中Ca2+/Calmodulin /NFATc1信号通路的发现是一个遑急冲破[3-5， 9]。CaMKⅡ是该信号通路中Ca2+信号传递的要道分子。
CaMKⅡ有α、β、γ、δ 4个异构体。海外计划标明，异构体δ在破骨细胞分化中作用可能最为要道。Chang等[7]计划发现，在破骨细胞分化初期，CaMKⅡδ抒发高涨，其特异性siRNA可显贵阻碍破骨细胞生成。Yao等[6]计划也发当前4个异构体中，只消CaMKⅡδ在破骨细胞分化中呈高水平抒发，且mRNA变化和卵白相一致。本课题组前期计划也证据，CaMKⅡδ在破骨细胞酿成的不同阶段呈时刻依赖性捏抒发增强，其mRNA和卵白抒发趋势一致；因此推断CaMKⅡδ可能在破骨细胞分化信号调控中发挥着遑急作用。
计划标明，CaMKⅡ与Ca2+/Calmodulin洽商后，得到两个特质[4]：(1)对Calmodulin的亲和力进步1000倍；(2) CaMKⅡ在无Calmodulin时仍具备部分酶的活性。因而，CaMKⅡ在破骨细胞分化经过中可能发挥遑急作用。本课题组前期计划发现，唑来膦酸不错时刻依赖性阻碍破骨细胞内Ca2+摇荡(oscillation)，并下调CaMKⅡ基因抒发及卵白活性[8]；提醒CaMKⅡ参与了唑唻膦酸对破骨细胞分化的阻碍。
CaMKⅡδ在破骨细胞分化中到底发挥怎么的作用，当前还知之甚少。为此，本现实选拔RNA干涉本领，特异性千里默CaMKⅡδ基因，以探讨其对破骨细胞生成的调控作用及触及的卑劣信号分子。现实截止走漏，CaMKⅡδ RAN干涉可清澈阻碍破骨细胞生成及骨招揽功能，使破骨细胞生成着落卓著了49.8%，骨招揽陷窝数量着落卓著了47.6%。上述截止提醒，CaMKⅡδ在破骨细胞分化调控中作用极为要道。
NFATc1行为破骨细胞的主要调整基因，参与好多破骨细胞特异性基因抒发的调控，包括cathepsin K、TRAP、integrinβ3、c-Src、DC-STAMP (dendritic cell-specific transmembra-ne protein)、Atp6v0d2等，对破骨细胞分化及骨招揽功能至关遑急[3-4， 9-10]。NFATc1及上述基因抒发相当会导致破骨细胞生成及功能严重防碍[11]。本计划发现，CaMKⅡδ RAN干涉可显贵缩小破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src卵白和mRNA水平，从而评释CaMKⅡδ对破骨细胞生成的阻碍可能是通过调控NFATc1、TRAP、c-Src基因抒发来发挥作用。
然则，CaMKⅡδ是通过卑劣哪些信号分子来调控NFATc1、TRAP、c-Src基因抒发，从而影响破骨细胞生成的，当前尚存在争议。Chang等[7]合计，CaMKⅡ与CaMKⅣ相通[5]bt工厂网址，是通过cAMP反映元件洽商卵白信号通路来发挥作用；Yao等[6]和Park-Min等[12]一致合计，CaMKⅡ是通过MEK-ERK信号通路来发挥作用。鉴于此，CaMKⅡδ卑劣信号调控通路，尚待进一步计划探讨。本计划证据，CaMKⅡδ RNA干涉可有用阻碍破骨细胞生成，并下调卑劣分子NFATc1、TRAP、c-Src基因抒发；CaMKⅡδ可能通过影响上述基因抒发发挥对破骨细胞分化的要道调控作用。